PCR (polymerázová řetězová reakce). Jak je diagnóza PCR, indikace, jak se připravit na studium, PCR výsledky

Pro přiměřené a účinné léčbě mnoha infekčních onemocnění musí být včas stanovit přesnou diagnózu. Při řešení tohoto problému dnes zapojeny high-tech diagnostické metody založené na metod molekulární biologie. V současné době, polymerázová řetězová reakce (PCR), se již široce používá v lékařské praxi jako nejspolehlivější nástroj pro účely diagnózy.

Co je příčinou popularity PCR v tuto chvíli?

Za prvé, tato metoda se používá pro detekci patogenů různých infekčních onemocnění s vysokou přesností.

Za druhé, pro sledování účinnosti léčby.

V různých návodů, brožur, článků a vysvětlení lékařů, jsme často potýkají s používáním nejasných pojmů a slov. Ve skutečnosti je obtížné hovořit o high-tech produkty vědy běžných slov.

Co je podstatou a mechanika diagnostické PCR?

Každý živý organismus má své vlastní jedinečné geny. Tyto geny jsou uspořádány v molekule DNA, která je ve skutečnosti „karta“ každého konkrétního organismu. DNA (genetický materiál) - velmi dlouhá molekula, která se skládá z „cihly“ zvané nukleotidy. Každý budič že leží zcela specifické infekční onemocnění, to znamená v určitém pořadí a kombinaci. Je-li nutné pochopit, zda osoba má daný patogen, stoupá biologického materiálu (krev, moč, sliny, tampóny), který obsahuje DNA nebo fragmentů DNA mikroba. Ale množství genetického materiálu patogenu je velmi malá, a to je nemožné říci, co přesně je mikroorganismus mu patří. Pro vyřešení tohoto problému a slouží jako PCR. Podstatou polymerázové řetězové reakce je to, že malé množství materiálu, je považována za vyšetřování, obsahující DNA, a proces PCR je zvýšení počtu genetického materiálu, který patří do určitého patogenu, a tak, že může být identifikován.

diagnostika PCR - genetické studie biomateriálu.

Myšlenka PCR patří americký vědec K.Mullins, kterou navrhla v roce 1983. Nicméně, rozšířené klinické použití získala pouze ve středním 90s XXveka.

Budeme rozumět terminologii, že je to - DNA, atd. Každá buňka každého živého tvora (zvíře, rostlina, člověk, bakterie, viry) má chromozóm. Chromozómy - chovatelé Tato genetická informace, které zahrnují celou sekvenci genů každé jednotlivé živé bytosti.

Každý chromozom je složen ze dvou řetězců DNA, stočených do spirály vzhledem k sobě navzájem. DNA - deoxyribonukleová kyselina je chemicky, které se skládají z konstrukčních prvků - nukleotidů. 5 je nukleotidová druh - thymin (T), adenosin (A), guanin (G), cytosin (C) a uracil (U). Nukleotidy jsou uspořádány za sebou v daném pořadí jednotlivých tvářecích genů. Jeden gen se může skládat z 20-200 nukleotidů takových. Například, gen kódující pro výrobu inzulínu, se skládá z 60 bp.

Nukleotidy jsou majetkem komplementarity. To znamená, že opačný na adenin (A) v jednom řetězci DNA požadované je tymin (T), na druhém řetězci, a naproti guanin (G) - cytosin (C). Schematicky takto:
D - D
T - A
A - T
Tato klíčová vlastnost komplementarity pro PCR.

Kromě DNA stejnou strukturu RNA - ribonukleová kyselina, která se liší od DNA v tom, že místo toho, thymin, uracil je v něm použit. RNA - genetická informace je správcem některých virů, tzv retroviry (například HIV).

       DNA a RNA molekuly mohou být „násobit“ (tato vlastnost se používá pro PCR). K tomu dochází následovně: dvě vlákna DNA nebo RNA, odchýlit se od každé straně druhé, každé vlákno dostane speciální enzym, který syntetizuje nový řetěz. Syntéza je princip komplementarity, tj, pokud se v původní DNA řetězce za nukleotidů A, pak se nově syntetizovaný bude T, je-li T - pak C, atd. Tento speciální enzym „builder“ v případě potřeby „semeno“ pro zahájení syntézy - sekvence nukleotidů 5-15. Tento „semeno“ je definován pro každý gen (gen chlamydie, mykoplazmy, viry) experimentálně.

Tak každý PCR cyklus se skládá ze tří kroků. V prvním kroku dochází k tzv odvíjení DNA - to je propojený separace dvou řetězců DNA. Ve druhé - je „semeno“ spojení do místa řetězců DNA. Konečně, rozšíření datové řetězce DNA, který je vyroben fermentom- „builder“. V současné době je tento komplex proces se vyskytuje v jedné zkumavce a sestává z opakujících se cyklů reprodukčního definovanou DNA vyrobit velký počet kopií, které mohou být následně detekovány běžnými způsoby. To je jeden z řetězců DNA dostáváme stovky nebo tisíce.

Etapy PCR studiích

Odběr vzorků biologického materiálu pro výzkum

Vzhledem k tomu, vzorek je jiný biologický materiál, krev a její složky, moč, sliny, slizniční sekrety, mozkomíšní mok, sekrety z rány ploch, obsah tělních dutin. Všechny biologické zkoušky shromážděny na jedno použití nástroje, a vytočil materiál uzavřen ve sterilní plastovou trubkou nebo umístěny na kultivačním médiu s následnou přepravy do laboratoře.

Získanou vzorku se přidá potřebné reagencie a dát do programovatelný termostat - termocykleru (termocykleru). Termocykléru PCR opakuje 30-50 krát cyklus sestávající ze tří fází (denaturace, žíhání a prodloužení). Co to znamená? Podívejme se na podrobnosti.

Fáze zneužít PCR reakci, kopírování genetického materiálu

já stupeň PCR - Příprava na kopírování genetického materiálu.
Vyskytuje se při teplotě 95 ° C, molekuly DNA se oddělí a mohou sedět „primer“.

„Primery“ se vyrábí průmyslovým způsobem různé vědecké a průmyslové svazy a laboratoře koupit ready-made. Dále jen „osivo“ pro identifikaci, jako jsou chlamydie, funguje pouze pro chlamydie, atd. Tedy, v případě, že biologický materiál je testován na přítomnost chlamydiové infekce, pak se reakční směs umístí „osivo“ pro hlamidiy- pokud testování biomateriál na virus Epstein-Barrové, a „semeno“ pro virus Epstein-Barrové.

II stupeň - odbor genetického materiálu infekčního agens a „semeno“.
Pokud je DNA definována viry nebo bakterie, „semeno“ sedí na DNA. Proces spojování „osivo“, je druhá fáze PCR. Tento krok se provádí při teplotě 75 ° C

III etapa - kopie genetického materiálu infekčního agens.
Tento proces vlastně prodloužení nebo rozmnožování genetického materiálu, který se vyskytuje při teplotě 72 ° C Pod pojmem „semeno“ je vhodný enzym „builder“ a syntetizuje nový řetězec DNA. S koncem syntézy nového konců řetězce DNA a PCR cyklu. To znamená, že jedno číslo cyklu PCR se zvyšuje genetický materiál dvakrát. Například, v původním vzorku měl 100 molekul DNA jakéhokoliv viru, po prvním cyklu PCR ve vzorku bude DNA molekuly pro 200 zkušebního viru. Cyklus trvá po dobu 2-3 minut.

Pro vytvoření dostatečného množství genetického materiálu pro identifikaci, byly provedeny obecně 30 až 50 cyklů PCR, která trvá 2-3 hodin.

Úroveň Identifikace šířeny genetický materiál

Ve skutečnosti PCR zde končí a dále je neméně významný stupeň identifikace. Pro identifikaci metodou elektroforézy nebo označeny jako „primer“. Když se používají elektroforéza získat řetězce DNA odděleny podle velikosti, a přítomnost DNA fragmenty různé délky, který ukazuje pozitivní výsledek analýzy (to znamená, že přítomnost viru, bakterie, atd.). Při použití značeného „semeno“ je přidán chromogen (barvivo) do finálního reakčního produktu, přičemž se enzymatická reakce doprovázené vybarvení. Barva Vývoj je přímý důkaz, že virus nebo jiné detekovatelné činidlo jsou přítomné v původním vzorku.

K dnešnímu dni, pomocí značené „primer“, jakož i příslušný software, je možno vyrábět najednou a „číst“ výsledky PCR. Je to tak nazyvaemayareal-time PCR.

Proč diagnostiku PCR má tuto hodnotu?

Jednou z významných výhod metody PCR je vysoká citlivost - 95 až 100%. Nicméně, tyto výhody by měly být založeny na vždy za následujících podmínek:

1. správný výběr, přepravu biologického materiálu;
2. dostupnosti sterilních jednorázových nástrojů, specializovaných laboratořích a vyškoleným personálem;
3. přísné dodržování sterilních podmínek a při analýze

Citlivost se liší pro různé bakterie zjištěny. Například, citlivost metody PCR pro detekci viru hepatitidy C je 97 až 98%, je citlivost pro detekci Ureaplasma - 99-100%.

Možnosti spojená s analýzou PCR, mohou dosáhnout bezkonkurenční analytickou specificitu. To znamená, že identifikace mikroorganismu je, že hledají, nejsou podobné nebo úzce souvisí.
Diagnostická citlivost a specificita metodou PCR, často vyšší než ty, pro kultivační metodou, která se nazývá „zlatý standard“ pro detekci infekčních onemocnění. S ohledem na trvání rostoucí kultury (od několika dnů do několika týdnů), tu výhodu, že PCR je evidentní.

PCR v diagnostice infekcí
Výhody metodou PCR (citlivost a specifičnost) definovat širokou škálu aplikací v moderní medicíně.
Hlavní aplikace diagnostiky PCR:

1. Diagnostika akutních a chronických infekčních chorob různého lokalizace
2. monitorování efektivnosti terapie
3. objasnění typ patogenu

PCR se používá v porodnictví, gynekologii a neonatologie a pediatrie, urologii, Venerologie, nefrologii, infekční onemocnění, kliniky oftalmologie, neurologie, Phthisiopneumology kol.

Použití PCR diagnostika se provádí ve spojení s jinými výzkumné metody (ELISA, PIF, NIF a kol.). Jejich kombinace a určuje vhodnost ošetřujícím lékařem.

infekční agens zjištěné metodou PCR

viry:

1. Retroviry HIV-1 a HIV-2
2. herpetiformis viry
3. virem herpes simplex typu 1 a 2
4. cytomegalovirus
5. virus Epstein-Barrové
6. Varicella - zoster virus
7. lidské herpes viry 6 a 7
8. hepatitida C, B a A
9. viry, lidský papilloma
10. rubivirus
11. adenoviry
12. rhinoviry
13. parvovirus
14. pikornovirusy

bakterie:

1. mykobakterie
2. chlamydie
3. mykoplazmatům
4. salmonela
5. Legionella
6. klostridií
7. bledá Treponema
8. Různé druhy patogenní E. coli
9. Vibrio cholerae
10. Rickettsia
11. aurococcus
12.  původce bakteriální meningitidy
13. Helicobacter pylori
14. Ureaplasma
15. kapavka
16. záškrt bacil
17. Haemophilus influenzae

V tomto seznamu jsou nejčastější infekční agens detekovány pomocí PCR. Ve skutečnosti je tento seznam je mnohem širší, neustále aktualizovány, jak je syntetizován nový „semeno“. Rovněž je třeba poznamenat, že seznam identifikovaných patogenů je určena přítomností „semena“ pro identifikaci v arzenálu každé jednotlivé laboratoře.


Autor: AK Nasedkina